从古至今，人类对微观天下的探索从未止步 。岂论是面包上野蛮生长的霉菌，照旧血液里一直转动的红细胞，都激起人们强烈的好奇 。为了知足这一探索的欲望，显微镜应运而生 。
随着对微观生物体研究需求的深入，通例光学显微镜区分局限于波长和孔径，无法清晰地区分其内部超微结构 。20世纪末期，具有划时代意义的激光共聚焦显微镜泛起了 。
图 通例光学显微镜
在某一期《非诚勿扰》上，一个男嘉宾提到“你透过我的瞳孔衍射在我的视网膜上留下一道艾里斑” 。而激光共聚焦显微镜之以是能够大幅提高区分率，就是在艾里斑下了功夫 。
图 通俗宽场显微镜(A)和激光共聚焦显微镜(B)的成像比照
艾里斑(Airy Disk)是点光源由于衍射而在焦点处形成的光斑 。中央是明亮的圆斑，周围有一圈圈较弱的明暗相间的同心环，就犹如涟漪一样平常 。我们看到的图像，着实是无数艾里斑叠加爆发的 。
图 艾里斑
通俗宽场显微镜网络了所有的光斑信号，包括周围较弱的环斑，会相互滋扰，因此成像就较量模糊 。而共聚焦显微镜巧妙地在光路中加入了针孔，选择性地吸收光斑中心焦平面信号最强的部分，由此提高了成像质量，区分率更高 。
图 通俗宽场显微镜和激光共聚焦显微镜的成像原理
有了激光共聚焦显微镜这一有力武器，科学家们对微生物和细胞的作育和视察越发精准 。为了筛选或识别出感兴趣的目的，种种表型识别手艺应运而生 。
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 图 表型识别手艺
1.1?荧光成像手艺
荧光就是在特定波长的引发下，可以显示出州波长的光（颜色） 。除了视察样品的固有自觉荧光之外，可以使用荧光探针、特异性抗体染色，或者通过基因重组表达荧光卵白 。通过荧鲜明微镜视察细胞是非经常见的研究方法，可以举行特定卵白、细胞器等在组织及细胞中漫衍、相互作用的视察 。
图 荧光卵白
荧鲜明微镜通常是使用高压汞灯作光源，除了通过目镜视察形态外，还使用可以检测微弱荧光的高迅速度CCD照相机捕获光信号，实现高质量成像 。
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 图 荧光光谱
在大部分情形下，荧光光谱中一个荧光物质对应一个峰 。不难发明，各个荧光光谱之间会爆发重叠，且不可负载过多种类的荧光，不然会相互滋扰 。同时，若是通过荧鲜明微镜视察微生物时，还需要面临前处置惩罚、自体荧光滋扰、探索荧光标记物的作用靶点、光漂白、光毒性等问题 。因此，在重大组分微生物和细胞的识别和筛选中，荧光成像难以提供详尽的信息 。
1.2?拉曼成像手艺
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 图 拉曼光谱反应的信息和手艺优势
拉曼光谱，或者说拉曼散射（Raman scattering），是由印度科学家Chandrasekhara Raman使用太阳光视察发明的，并获得了1930年度的诺贝尔物理学奖 。他发明，当光穿过透明介质，部分被散射的光爆发频率改变 。
详细而言就是，绝大大都光子打到一个分子上，会爆发弹性碰撞，波长和频率都没有转变，称为瑞利散射（Rayleigh scattering） 。而有一小部分的光子，其能量被分子的各个化学键吸收了，实现能量交流，光的波长和频率就爆发了转变 。转变的纪律和分子结构、形态、结晶度息息相关，这一征象被称之为拉曼散射，以此组成了拉曼光谱，又可以称为“分子指纹” 。若是能精准地捕获到拉曼散射，就能实现物质的识别 。
拉曼光谱反应的是分子最真实的状态，因此不需要对样品举行预处置惩罚，实现了真正的无损、原位、实时和精准检测 。在生命科学、生物医药等领域，拉曼都是研究的热门 。
细菌、微生物判断是一个生物发酵行业最为焦点的研究内容，古板的细菌分类法使用最多的是通过菌落的形态和心理生化反应效果对细菌举行判断，如细菌作育法、生化判断等要领 。这些要领费时艰辛，操作重大并且易蜕化，难以疏散相似的菌种 。新兴的分子生物学实验如PCR，则对样品纯度和浓度要求较高，操作难度更大，本钱高，也难以区分基因型相似的菌株 。而上述的问题限制了生物发酵行业的生长，最大的痛点就是无法找到有用的菌株，面临铺满作育皿、形态各异的菌群，就犹如大海捞针 。
拉曼光谱作为一种快速无损的判断手段，无需扩培或者主观剖析形态，就可以剖析单个细菌和微生物，在物种和菌株水平上举行分类，筛选新型、高效菌种 。
图 差别菌株的拉曼光谱
1.3?红外光谱手艺
除了拉曼光谱，尚有一类振动光谱叫做红外光谱（Infrared spectrometry） 。分子吸收某些波长的红外线后，分子振动能级跃迁 (同时陪同转动能级跃迁)，分子偶极矩转变是红外光谱爆发的缘故原由 。红外光谱是能够定量举行因素判断的剖析要领 。
（2）红外更易检测，信号更强 。拉曼信号更弱，可是没有重叠谱带 ；
（3）拉曼可以检测水溶液（水的拉曼散射很弱），红外不适用于水溶液样品的测定 ；
（4）检测拉曼光谱不需要提前处置惩罚样品，红外样品检测需要预处置惩罚 ；
（5）拉曼谱图提供的信息更周全，除了吸收频率、强度、峰形（这三要素红外光谱会提供），尚有去偏振度 ；
（6）拉曼光谱能够在玻璃仪器中检测，而红外光谱不可 。
拉曼和红外光谱都能够反应分子结构信息，两者是互补的特征 。然而拉曼散射光极其微弱，由于当光照射到样品上时，仅有万万分之一的概率会爆发拉曼散射 。犹如在案发明场需要战战兢兢地收罗指纹，作为“分子指纹”的拉曼光谱，在收罗上也颇有难度，一有误差，就会爆发“冤假错案” 。因此在很长一段时间里这项手艺陷入瓶颈期，更易检测的红外光谱顺势生长 。而随着激光器的问世，能够提供更多精准信息的拉曼光谱获得重视，最先普遍应用于各个领域 。
拉曼成像装备需要搭配极其优异的光学组件和多维矫正装备，开发手艺壁垒高 。拉曼共聚焦显微镜品牌主要有Thermo Scientific、HORIBA、Oxford Instrument WITec等老牌厂商 。
图 Thermo Scientific DXR3xi 拉曼成像显微镜
图 HORIBA XploRA INV多功效拉曼及成像光谱仪
图 Oxford Instrument WITec alpha300 R拉曼成像显微镜
反观海内市场，共聚焦拉曼显微镜等高端光学仪器仍由入口厂商主导，国产替换亟需加速 。高校、研究所，是孕育新兴手艺的沃土，光学也不破例 。以长春光机所、西安光机所为首的中国光学领域研究所，要实现要害焦点器件的自主可控，要害焦点器件是高端光电仪器的主要攻关偏向，未来才华够突破现在“卡脖子”的时势，为国产光学仪器争取一席之地 。
中国科学院长春光学细密机械与物理研究所（简称“长春光机所”）始建于1952年，由中科院长春光机所与中科院长春物理所于1999年整合而成，是新中国在光学领域建设的第一个研究所，主要从事发光学、应用光学、光学工程、细密机械与仪器的研爆发产，被誉为中国光学的摇篮 。
建所70年来，长春光机所在以王大珩院士、徐叙瑢院士等为代表的一批科学家的向导下，创立了十几项“中国第一” ；组建、援建了10余家科研机构、大专院校和企业单位，并为其运送了2200多名种种专业人才 ；有27位在本所学习或者事情过的优异科学家中选为两院院士，并涌现出“知识分子的优异代表”蒋筑英等众多英模人物 ；先后加入了“两弹一星”、“载人航天工程”等多项国家重大工程项目，为我国国防建设、经济生长和社会前进做出了突出孝顺 。
中国科学院西安光学细密机械研究所（简称“西安光机所”）建设于1962年，是中国科学院在西北地区最大的研究所之一 。研究所科研系统设有四大研究部，划分是基础科研部、光电手艺部、空天手艺部、先进制造部，下设26个研究单位，科研系统包括一个国家重点实验室、三其中科院重点实验室、两个陕西省工程手艺中心、一个陕西省重点实验室，依托响应研究单位建设运行 。并拥有完整的手艺支持系统 。
现有在职职员955人，高级科研职员400人，其中正高128人、中国科学院院士1人，国务院特殊津贴专家16人，种种国家级人才12人 。龚祖同砚部委员（院士）、侯洵院士、薛鸣球院士、牛憨笨院士、相里斌院士均出自西安光机所 。
6. Advanced fluorescence microscopy techniques—FRAP, flip, flap, FRET and flim
7. Raman Investigation of Microorganisms on a Single Cell Level
10. Thermo Fisher Scientific 官网
